经常看到一些饼图，描述某些事物的组成，比如说有钱人的学历分布，然后我们可以看到高学历所占比例并不高，根据这个比例下结论通常是错的，这些比例说明不了问题，如果把各种学历在总体人口中的分布做为背景进行考虑的话，你就会发现学历还是有点用的。 当我们用组学测定了一大堆分子之后，我们希望站在更高的角度去看这些分子和那些生物学过程相关。那么通常各种注释，对这些基因/蛋白进行分类，那么从分类的比例上，是不能草率下结论，正如上面有钱人学历分布的例子一样。我们需要把总体的分布考虑进去。 和某个注释/分类是否有相关性，把基因分成属于这一类，和不属于这一类两种，这就好比经典统计学中的白球和黑球的抽样问题。也可以列一个２x２的表，进行独立性分析。 以文章Gene Expression in Ovarian Cancer Reflects Both Morphology and Biological Behavior, Distinguishing Clear Cell from Other Poor-Prognosis Ovarian Carcinomas所鉴定的差异基因为例。

73个差异基因的Symbol，我把它转为 entrezgene ID得到57个（漏掉的不管它，只是做为一个例子）:

> eg
 [1] "7980"   "3081"   "3162"   "3059"   "1545"   "1917"   "6696"   "5797"  
 [9] "6648"   "10397"  "6781"   "5817"   "1282"   "1284"   "6948"   "7077"  
[17] "5744"   "8566"   "1368"   "1474"   "11015"  "3306"   "728441" "2678"  
[25] "4286"   "3929"   "5095"   "2064"   "1428"   "6590"   "3569"   "2745"  
[33] "3912"   "978"    "5950"   "6539"   "9445"   "5004"   "9971"   "7453"  
[41] "2719"   "1410"   "1311"   "4653"   "4162"   "5358"   "3484"   "3486"  
[49] "2261"   "307"    "1672"   "4837"   "22795"  "486"    "4118"   "3915"  
[57] "10140"

下面测试一下这些基因和化学刺激响应的相关性。

goid <- “GO:0042221” # response to chemical stimulus

那么做为背景，总体基因为N，属于“化学刺激响应”这个分类的基因有M个。

allgeneInCategory <- unique(get(goid, org.Hs.egGO2ALLEGS))
M <- length(allgeneInCategory)
N <- length(mappedkeys(org.Hs.egGO))

样本的大小是n，属于“化学刺激响应”这个分类的基因有k个。

n <- length(eg)
k <- sum(eg %in% allgeneInCategory)

白球黑球问题，最简单的莫过于用二项式分布，从总体上看，要拿到一个基因属于“化学刺激响应”这个分类的概率是M/N。那么现在抽了n个基因，里面有k个基于这个分类，p值为：

> 1-sum(sapply(0:k-1, function(i) choose(n,i) * (M/N)^i * (1-M/N)^(n-i)))
[1] 8.561432e-10

二项式分布，是有放回的抽样，你可以多次抽到同一基因，这是不符合的。所以这个计算只能说是做为近似的估计值，无放回的抽样，符合超几何分布，通过超几何分布的计算，p值为：

> phyper(k-1,M, N-M, n, lower.tail=FALSE)
[1] 7.879194e-10

如果用2x2表做独立性分析，表如下：

> d <- data.frame(gene.not.interest=c(M-k, N-M-n+k), gene.in.interest=c(k, n-k))
> row.names(d) <- c("In_category", "not_in_category")
> d
                gene.not.interest gene.in.interest
In_category                  2613               28
not_in_category             15310               29

这个也有很多方法可以做检验，经典的有卡方检验和fisher’s exact test。 如果用卡方检验来做。

> chisq.test(d, )

    Pearson's Chi-squared test with Yates' continuity correction

data:  d 
X-squared = 51.3849, df = 1, p-value = 7.592e-13

对于２x２表来说，卡方检验通常也只能做为近似估计值，特别是当sample size或expected all count比较小的时候，计算并不准确。 fisher’s exact test，名副其实，真的就比较exact，因为它使用的是超几何分布来计算p值。这也是为什么fisher’s exact test和超几何模式计算的p-值是一样的，

> fisher.test(d)

    Fisher's Exact Test for Count Data

data:  d 
p-value = 7.879e-10
alternative hypothesis: true odds ratio is not equal to 1 
95 percent confidence interval:
 0.1013210 0.3089718 
sample estimates:
odds ratio 
 0.1767937

通常各种软件做GO富集性分析，都是使用超几何分布进行计算。 IPA软件则是使用fisher’s exact test来检验基因在某个网络中是否富集。 从这个例子上看，chi-squared test的表现最差，binomial做为p值的近似估计还是不错的，因为计算较为简单。 富集性分析应用范围非常广，从Disease Ontology, Gene Ontology, KEGG, 到Reactome Pathway等等。