这一次讲解非常重要的peak注释，注释在ChIPseeker里只需要用到一个函数annotatePeak，它可以满足大家各方面的需求。

输入

当然需要我们上次讲到的BED文件，ChIPseeker自带了5个BED文件，用getSampleFiles()可以拿到文件的全路径，它返回的是个named list，我这里取第4个文件来演示。annotatePeak的输入也可以是GRanges对象，你如果用R做peak calling的话,直接就可以衔接上ChIPseeker了。

> require(ChIPseeker)
> f = getSampleFiles()[[4]]

巧妇难为无米之炊，就像拿到fastq要跑BWA，你需要全基因组的序列一样，做注释当然需要注释信息，基因的起始终止，基因有那些内含子，外显子，以及它们的起始终止，非编码区的位置，功能元件的位置等各种信息。

很多软件会针对特定的物种去整理这些信息供软件使用，但这样就限制了软件的物种支持，有些开发者写软件本意也是解决自己的问题，可能对自己的研究无关的物种也没兴趣去支持。

然而ChIPseeker支持所有的物种，你没有看错，ChIPseeker没有物种限制，当然这是有前提的，物种本身起码是有基因的位置这些注释信息，不然就变无米之炊了。

这里我们需要的是一个TxDb对象，这个TxDb就包含了我们需要的各种信息，ChIPseeker会把信息抽取出来，用于注释时使用。

> require(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
> txdb = TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene
> x = annotatePeak(f, tssRegion=c(-1000, 1000), TxDb=txdb)
>> loading peak file...				 2017-03-09 11:29:18 PM 
>> preparing features information...		 2017-03-09 11:29:18 PM 
>> identifying nearest features...		 2017-03-09 11:29:19 PM 
>> calculating distance from peak to TSS...	 2017-03-09 11:29:20 PM 
>> assigning genomic annotation...		 2017-03-09 11:29:20 PM 
>> assigning chromosome lengths			 2017-03-09 11:29:42 PM 
>> done...					 2017-03-09 11:29:42 PM

这里需要注意的是，启动子区域是没有明确的定义的，所以你可能需要指定tssRegion，把基因起始转录位点的上下游区域来做为启动子区域。

有了这两个输入（BED文件和TxDb对象），你就可以跑注释了，然后就可以出结果了。

输出

如果在R里打输出的对象，它会告诉我们ChIPseq的位点落在基因组上什么样的区域，分布情况如何。

> x
Annotated peaks generated by ChIPseeker
1331/1331  peaks were annotated
Genomic Annotation Summary:
             Feature  Frequency
9           Promoter 48.1592787
4             5' UTR  0.7513148
3             3' UTR  4.2073629
1           1st Exon  0.7513148
7         Other Exon  3.9068370
2         1st Intron  3.6814425
8       Other Intron  7.7385424
6 Downstream (<=3kb)  1.1269722
5  Distal Intergenic 29.6769346

如果我想看具体的信息呢？你可以用as.GRanges方法，这里我只打印前三行：

Bioconductor里有很多包是针对GRanges对象的，这样方便你在R里做后续的处理，如果你说你不懂这些，只想输出个Excel表格。那么也很容易，用as.data.frame就可以转成data.frame，然后你就可以用write.table输出表格了。

两种不同的注释

这里注释有两种，一种是genomic annotation (也就是annotation这一列）还有就是nearest gene annotation（也就是多出来的其它列）。

经常有人问我问题，把这两种搞混。genomic annotation注释的是peak的位置，它落在什么地方了，可以是UTR，可以是内含子或者外显子。

而最近基因是peak相对于转录起始位点的距离，不管这个peak是落在内含子或者别的什么位置上，即使它落在基因间区上，我都能够找到一个离它最近的基因（即使它可能非常远）。

这两种注释的策略是不一样的。针对不同的问题。第一种策略peak所在位置，可能就是调控的根本，比如你要做可变剪切的，最近基因的注释显然不是你关注的点。

而做基因表达调控的，当然promoter区域是重点，离结合位点最近的基因更有可能被调控。

最近基因的注释信息虽然是以基因为单位给出，但我们针对的是转录起始位点来计算距离，针对于不同的转录本，一个基因可能有多个转录起始位点，所以注释是在转录本的水平上进行的，我们可以看到输出有一列是transcriptId.

第三种注释

两种注释有时候还不够，我想看peak上下游某个范围内（比如说-5k到5k的距离）都有什么基因，annotatePeak也可以做到。

你只要传个参数说你要这个信息，还有什么区间内，就可以了。

x = annotatePeak(f[[4]], tssRegion=c(-1000, 1000), TxDb=txdb, addFlankGeneInfo=TRUE, flankDistance=5000)

输出中多三列: flank_txIds, flank_geneIds和flank_gene_distances，在指定范围内所有的基因都被列出。

基因注释

对于通常情况找最近基因的策略，最近基因给出来了，但都是各种人类不友好的ID，我们不能把一切都交给计算机，输出的结果我们还是要看一看的，能不能把基因的ID换成对人类友好的基因名，并给出描述性的全称，这个必然可以有。

只需要给annotatePeak传入annoDb参数就行了。

如果你的TxDb的基因ID是Entrez，它会转成ENSEMBL，反之亦然，当然不管是那一种，都会给出SYMBOL，还有描述性的GENENAME.

Citation

Yu G, Wang LG and He QY*. ChIPseeker: an R/Bioconductor package for ChIP peak annotation, comparison and visualization. Bioinformatics 2015, 31(14):2382-2383.